細胞係在生物科學中被廣泛使用，它們(men) 無限增殖的能力意味著，從(cong) 理論上講，科學家們(men) 可以精確地複製以前的研究重現實驗結果或者在此結果基礎上做更深入的研究。但是細胞係被貼錯標簽或處理不當會(hui) 導致有問題的細胞係的錯誤識別，汙染和/或傳(chuan) 播，進而可能影響研究數據的有效性和準確性。

科學研究中所用細胞係的真實性驗證是基礎而且必要的。真實性驗證能夠確保細胞沒有鑒定錯誤、沒有交叉汙染、遺傳(chuan) 上與(yu) 起始保存樣品沒有差異。那在科學研究工作中應該如何選擇所需要的細胞？如何獲取實驗所需細胞？所選用的或得到的細胞可靠性如何？如何判斷？這些問題對於(yu) 需要使用細胞進行研究工作的科研人員是必須首先解決(jue) 的問題。希望大家能在接下來的內(nei) 容中找到答案。

一、細胞來源
細胞係可以 1) 直接從(cong) 各種正常組織直接取材，進行原代培養(yang) ，2) 可以從(cong) 其他實驗室獲得，3) 也可以從(cong) 細胞庫購買(mai) 。無論采用何種來源，都必須確保對細胞進行身份驗證，並且沒有汙染，例如支原體(ti) 。那不同來源的細胞需要注意哪些問題呢？
1、直接取材，進行原代培養(yang) 獲得
從(cong) 新鮮組織中衍生出一種新的細胞係，特別是人類細胞，是一項昂貴且費時的工作。新細胞係的後續價(jia) 值將取決(jue) 於(yu) 驗證其來源的能力以及相關(guan) 的可用信息。這些信息包括細胞來源組織，臨(lin) 床資料，其他相關(guan) 信息。
（1）細胞來源組織：首先需要獲得捐助者或患者的同意和/或道德審查許可。另外，要記錄組織來源，進行組織病理學驗證，與(yu) 正常組織進行比較。
（a）將用於(yu) 原代培養(yang) 的一小部分樣品（或血液樣品或來自供體(ti) 的 DNA）立即冷凍或處理。然後可以使用組織或 DNA 明確證明該細胞係源自推定的供體(ti) 。盡管基因型（核型，拷貝數變異（CNV）作圖分析，甚至全基因組序列）的其他信息有時會(hui) 有助於(yu) 確保身份，但建議采用短串聯重複序列（STR）進行身份驗證。
（b）理想的情況是，用於(yu) 組織病理學驗證的組織最好由同一組織病理學家報告手術標本。如果患者樣本由臨(lin) 床醫生直接提供給實驗室，則此步驟特別重要，因為(wei) 它可能無法代表發送給組織病理學家的手術樣本。例如，它可能距腫瘤一定距離並因此缺乏癌細胞，或者可能來自不受遺傳(chuan) 或表觀遺傳(chuan) 缺陷引起的特定病理學影響的區域。
（c）少量血液（例如 10 毫升）或正常組織應冷凍。該組織以後可用於(yu) 尋找遺傳(chuan) 差異，也可用於(yu) 身份驗證。對於(yu) iPSC 品係，或當使用直接重編程從(cong) 一種衍生出另一種體(ti) 細胞類型時，冷凍保存所用原始細胞的儲(chu) 備液也是一種好習(xi) 慣。這些對於(yu) 使用新的重編程技術衍生出其他細胞係可能很重要，而且對於(yu) 提供原始供體(ti) 材料以驗證使用該細胞係的後來發現也可能很重要。如果使用體(ti) 細胞核移植（SCNT）或「克隆」技術來衍生細胞係，例如 ES 細胞，則應分別保留來自體(ti) 細胞供體(ti) 和卵母細胞供體(ti) 的細胞或組織，以匹配核和線粒體(ti) DNA。

（2）臨(lin) 床資料：如果捐贈者或患者表示同意並經過道德審查，則應盡可能多地記錄和存儲(chu) 以下盡可能多的信息。用於(yu) 明確識別捐贈者的信息（包括姓名，醫院編號，地址和出生日期）應以更高的安全性存儲(chu) ，最好與(yu) 其他數據分開存儲(chu) 。在英國，需要 NHS 合同或名譽合同來獲得患者詳細信息，並且此類信息切勿與(yu) 未經授權的同事共享或發布到公共領域。
（a）供體(ti) /患者的年齡和性別
（b）醫院和病理編號
（c）組織標本的起源部位和性質
（d）癌症或其他綜合症或病理的階段和等級
（e）組織病理學報告的副本
（f）臨(lin) 床病史包括治療
（g）其他信息，例如腫瘤標記物狀態，遺傳(chuan) 信息和家庭數據等
（h）捐助者的知情同意和放棄商業(ye) 權利的證據

（3）其他相關(guan) 信息：關(guan) 於(yu) 該細胞係的起源和派生保留的信息越多，該細胞係對始發者和任何後續用戶有用的可能性就越大。這些信息包括：所有培養(yang) 基和添加劑的類型，來源和批號以及建立細胞係的方法；使用抗生素情況，支原體(ti) 檢測情況；細胞係是否經過基因修飾；對於(yu) iPSC 或通過直接重編程衍生的細胞係，應描述所用方法，包括所用基因和載體(ti) 等等。

2、從(cong) 其他實驗室獲得
從(cong) 其他實驗獲得細胞這種途徑存在許多潛在的危害。細胞係可能根本不是他們(men) 聲稱的那樣，並且不能保證它仍然是同一細胞係或具有與(yu) 已發布描述的相同屬性。如果接收實驗室希望依靠通過細胞係獲得的曆史數據，則在接受進入的細胞係用於(yu) 一般用途之前，應進行驗證。
在收到細胞細後，同時在在凍存之前，應使用已經批準的基於(yu) DNA 的方法進行細胞係鑒定，以確認細胞係的起源並檢查錯誤識別。對照國際細胞係認證委員會(hui) （ICLAC）錯誤識別的細胞係數據庫來檢查細胞係名稱。在將新的細胞係存入液氮時應重新用 STR 對細胞身份進行驗證。人類細胞係可能攜帶病原體(ti) ，包括病毒汙染，對實驗室工作人員構成潛在的健康危害。它們(men) 還可能被細菌，真菌，支原體(ti) 或病毒汙染，並可能擴散到其他細胞係。如果要將這些細胞用於(yu) 動物，必須對它們(men) 進行測試並證明不含相關(guan) 病原體(ti) ，這一點也很重要。否則這些病原體(ti) 可能會(hui) 對動物或者照顧動物的科研人員帶來危害。
新細胞係應在實驗室和儲(chu) 存中進行隔離，直到對它們(men) 的來源進行鑒定，並證明它們(men) 不含微生物。最佳方法是擁有 II 級微生物安全櫃（MSC）和專(zhuan) 用於(yu) 隔離區的培養(yang) 箱。如果無法做到這一點，則應采取其他步驟以zui大程度地減少汙染擴散的風險，其中包括（a）僅(jin) 當當天所有其他細胞培養(yang) 完成後才對新細胞係進行處理，（b）在進入普通培養(yang) 箱之前，應應將新的培養(yang) 物放置在專(zhuan) 用培養(yang) 箱中或密封容器中；（c）使用後，應使用合適的非腐蝕性消毒劑清潔 MSC，並在關(guan) 閉前再運行至少 5 分鍾。
用戶還應確認他們(men) 獲得的細胞係適合於(yu) 他們(men) 自己的特定目的。即使顯示出細胞係是真實的，它也可能會(hui) 隨著傳(chuan) 代時間的延長而失去特定的關(guan) 鍵特征。 核型分析是一種簡單的測試，可以揭示細胞係的變化。在開始工作之前確認適當的特性可以節省大量的時間和精力。

3、從(cong) 細胞庫購買(mai)
學術機構或商業(ye) 機構已經建立了許多保藏中心或細胞庫。這些來源的細胞係已經進行了驗證，並鑒定其在培養(yang) 物中常見的汙染微生物，因此除非隨附信息中另有說明，否則它們(men) 不太可能被汙染或錯誤識別。但是，其中一些細胞係是在實驗室之間多次轉移後獲得的，因此，除非在分析證書(shu) 中明確說明，否則不能保證真實性和不受微生物汙染的影響。這些保藏中心或者細胞庫會(hui) 對其細胞係進行常規驗證，並為(wei) 細胞係提供分析證書(shu) ，包括 STR 分型報告。

二、細胞儲(chu) 存

一旦細胞係已經開發或獲得並驗證（即顯示為(wei) 真實且未受汙染），確保可靠且可重現的細胞供應的第一步是冷凍保存約 20 個(ge) 1 ml 安瓿瓶，每個(ge) 安瓿瓶中裝有 1~5*10^6 個(ge) 細胞。這將為(wei) 絕大多數實驗室提供多年的現成貨源。通常是在防腐劑（通常是含有 10％DMSO 的生長培養(yang) 基）中緩慢（通常 1 ℃ min-1）冷凍樣品來保存細胞係。某些細胞類型，例如 hESC，可能需要超速冷凍或玻璃化，其中水被原位冷凍形成玻璃，並且不允許像慢速冷凍一樣從(cong) 細胞中滲透出來，通常用於(yu) 冷凍幹細胞。每次冷凍一批細胞時，建議立即複蘇一個(ge) 小瓶以檢查其生存能力。從(cong) 庫中取出的小瓶應快速融化（通過浸入 37°C 的水浴中），並用預熱的培養(yang) 基逐漸稀釋細胞懸液。必須將可能具有傳(chuan) 染性的材料存儲(chu) 在氣相液氮中，以減少汙染性生物轉移的風險。安全起見，重要的物料（例如 MCB）可以分開儲(chu) 存到一個(ge) 以上的儲(chu) 存容器中，最好在放置到不同的位置，做好使用的登記記錄。細胞的位置應在電子表格或數據庫中詳細說明，並與(yu) 細胞係的起源和特征以及已應用的質量控製措施的詳細信息進行關(guan) 聯。冷凍儲(chu) 藏容器應裝有警報器，並定期檢查儲(chu) 存溫度。建議每周至少一次記錄儲(chu) 存容器中液氮的水平。對定期維護，監視和庫存控製的證據進行定期審核還將有助於(yu) 確保存儲(chu) 設施的安全性。

三、細胞錯誤識別
錯誤識別是由於(yu) 交叉汙染，控製不當或文書(shu) 錯誤造成的，並暗示了良好的細胞培養(yang) 方法（GCCP）的失敗；例如，將細胞意外轉移到培養(yang) 基的儲(chu) 液瓶中，該儲(chu) 液瓶在 MSC 中同時具有兩(liang) 個(ge) 細胞係，貼錯了燒瓶或安瓿的標簽，或解凍了錯誤的安瓿。交叉汙染的其他來源是飼養(yang) 細胞（例如，在 ES 細胞培養(yang) 中經常使用的）由於(yu) 輻照或 siliemeisuC 處理不充分仍具有有絲(si) 分裂活性，或者是製備的條件培養(yang) 基且未進行充分過濾以除去細胞。每當在實驗室中維持快速生長的連續細胞係時，就有可能交叉汙染（即替換）其他生長較慢的細胞係的風險。我們(men) 可以從(cong) ICLAC（ICLAC，2013a）獲得已知的錯誤識別的細胞係列表。但是，即使某個(ge) 細胞係不在該列表中，實驗室也應始終進行測試以確保其自身的該細胞係庫存是真實的。因此，必須采取簡單的預防措施以zui大程度地減少細胞錯誤識別的可能性，這些措施包括：
（1）所有培養(yang) 容器以及存儲(chu) 容器都必須小心且正確地貼上標簽（包括細胞係的全名，傳(chuan) 代號和轉移日期）；
（2）生物安全櫃一次隻能使用一個(ge) 細胞係。 取出細胞後，應在安全櫃中用適當的液體(ti) 消毒劑擦拭並運行至少 5 分鍾，然後再引入另一個(ge) 細胞係；
（3）瓶或等分試樣隻能用於(yu) 一個(ge) 細胞係；
（4）氣溶膠的形成必須控製在最小程度；
（5）應定期返還冷凍存量（除非必要，否則切勿細胞係連續培養(yang) 43 個(ge) 月或 10 代）

四、細胞的真實性驗證
不管原代培養(yang) 還是引進，細胞使用時仍需進行適當鑒定。培養(yang) 細胞的鑒定主要有 6 個(ge) 方麵的要求：
1 證實其來源的物種
通過細胞遺傳(chuan) 學進行染色體(ti) 檢測，進行細胞同工酶種類的檢測，一方麵確認其起源物質，另一方麵排除與(yu) 其他種屬來源細胞的交叉汙染。
2 與(yu) 來源組織的關(guan) 係
通過免疫細胞化學、RT-PCR、Western Blot 等方法，檢測細胞中特定分子的表達，確定細胞所在組織中的細胞類型；確定細胞所處的分化發育過程中的位置（例如, 幹細胞階段、前體(ti) 細胞階段或分化階段）。
3 確定細胞係是否轉化
通過體(ti) 內(nei) 移植，成瘤性觀察實驗，明確該細胞係是有限細胞係還是連續細胞係；細胞係是否表達惡性特征。
4 確定無細胞係交叉汙染
通過細胞 DNA 分型（指紋、SSP、STR、SNP）分析，與(yu) 細胞培養(yang) 初代和同一來源組織、血液細胞 DNA 型進行比較，確認細胞係無交叉汙染。也可通過同工酶檢測及細胞遺傳(chuan) 學檢測。
5 是否有跡象表明細胞係有遺傳(chuan) 不穩定的傾(qing) 向性，易於(yu) 轉化和表型的多樣性
通過染色體(ti) 分析或 FISH 等檢測進行觀察和證明。
6 特定細胞係需要特征的證明
一組起源相同的細胞中的特定細胞係，挑選出的細胞株或雜交細胞係，需要提供該細胞係或細胞株特征的證明，如分子標記特征。

具體(ti) 到每株細胞係，並不是所有的指標都進行實驗驗證。STR 分型分析是鑒定細胞係的標準方法。美國標準（ASN-0002 2011）提供了有關(guan) 如何使用 STR 分析進行人類細胞係認證的信息。應遵循該標準的建議，包括使用至少八個(ge) 核心 STR 基因座和應用匹配標準（匹配閾值 80％），以允許某些細胞係中發生少量遺傳(chuan) 漂移。

五、支原體(ti) 汙染
1950 年代shou次注意到細胞培養(yang) 物被支原體(ti) 汙染，但令人遺憾的是仍然經常忽略它的存在。我們(men) 要清楚的知道如下幾點，對於(yu) 我們(men) 在平常實驗中重視支原體(ti) 汙染問題非常重要。
（1）在世界範圍內(nei) ，支原體(ti) 汙染非常頻繁。
（2）使用有支原體(ti) 汙染的細胞會(hui) 導致錯誤，誤導或錯誤的實驗結果。
（3）由於(yu) 缺乏明顯的體(ti) 征，支原體(ti) 陽性細胞培養(yang) 可能不被注意。
（4）注意支原體(ti) 汙染的潛在來源
（5）使用良好的無菌技術和實驗室操作規程，避免支原體(ti) 汙染。
（6）對所有未經測試的細胞係采取有效的隔離程序。
（7）建立定期和連續的支原體(ti) 檢測程序。
（8）科學期刊開始接受支原體(ti) 檢測的證據，然後再接受論文發表。
支原體(ti) 汙染對宿主真核細胞的影響程度變化很大，但已顯示出它可以改變許多宿主細胞的功能，包括生長，形態，代謝，基因組和抗原性。因此，在實驗中使用被支原體(ti) 汙染的培養(yang) 物將引來對所產(chan) 生的任何研究數據的有效性和重要性的明顯質疑，並可能導致發表錯誤的實驗結果。現在越來越多的期刊在接受論文發表前要求提供證據證明研究中已使用細胞培養(yang) 物不存在支原體(ti) 的汙染。

六、總結

1、啟動新的細胞係時，請記錄與(yu) 組織起源有關(guan) 的所有數據，並保留組織用於(yu) DNA 分析。

2、確保新細胞係的名稱是唯yi的。

3、獲得的細胞係應來自可靠的來源，並且必須經過身份驗證以避免錯誤識別。

4、應當將經過身份驗證的細胞保存起來，以備將來使用，並定期從(cong) 冷凍庫中更換培養(yang) 物。

5、獲取細胞係組織有道德和法律上的要求。使用人體(ti) 組織樣品通常需要患者同意，並且必須定義(yi) 所有權。

6、將人體(ti) 組織樣本作為(wei) 可能具有傳(chuan) 染性的材料處理。

7、在開始實驗之前，為(wei) 所有類型的實驗室廢物建立正確的處置途徑，確保工作人員接受適當的培訓。

8、從(cong) 信譽良好的來源購買(mai) 培養(yang) 基和試劑（尤其是血清）。

9、記錄實驗所用的所有試劑和介質的批號。

10、建立「標準操作程序」（SOP）。良好的細胞操作規範可以很大程度上避免其他汙染。

11、確保實驗室設備的所有物品（櫃，培養(yang) 箱，高壓滅菌器，水過濾裝置等）均得到適當維修，並在規定的範圍內(nei) 工作。

12、錯誤識別仍然是一個(ge) 主要問題，因此所有細胞係均應從(cong) 可靠來源獲得並證明是真實的。

13、支原體(ti) 的汙染仍然很普遍，需要良好的組織培養(yang) 實踐和頻繁的測試以確保細胞係清除汙染。

迄今為(wei) 止，隻有少數的研究實驗室和科學期刊采取措施來改變繼續使用錯誤標識的細胞係的可怕局麵，承擔著發布高質量受控數據的責任。毋庸置疑，期刊和科學協會(hui) 的企業(ye) 將極大地促進此類質量控製措施並加速其廣泛接受。讓我們(men) 大家共同努力，從(cong) 你我做起，保證所發表的文章數據真實可信，可被重複。