01、複蘇

細胞複蘇的原則： 快速融化
必須將凍存在-196℃液氮中的細胞快速融化至37℃，使細胞外凍存時的冰晶迅速融化，避免冰晶緩慢融化時進入細胞形成再結晶，對細胞造成損害。

實驗前準備
將水浴鍋提前預熱至37℃。
細胞實驗室進行常規消毒，用75％酒精擦拭紫外線照射40min的超淨工作台台麵，保證無菌。
在超淨工作台中按次序擺放好消過毒的離心管、吸管、培養(yang) 瓶等即將使用的耗材及試劑。

取出凍存管
根據細胞凍存記錄按標簽找到所需細胞的對應編號。
從(cong) 液氮罐中取出細胞盒，取出所需的細胞，同時核對管外的編號。

迅速解凍
迅速將凍存管投入到已經預熱的水浴鍋中迅速解凍，並要不斷的搖動，使管中的液體(ti) 迅速融化。
約1-2min後凍存管內(nei) 液體(ti) 完quan溶解，取出用酒精棉球擦拭凍存管的外壁，再拿入超淨台內(nei) 。

平衡離心
用架盤天平平衡後，放入離心機中3000r/min離心3分鍾。

製備細胞懸液
吸棄上清液。
向離心管內(nei) 加入適量完quan培養(yang) 液，吹打製成細胞懸液。
用培養(yang) 液懸液混懸沉澱細胞，細胞計數調整細胞濃度，放入培養(yang) 箱中培養(yang) 。

細胞計數
細胞濃度以5×10 5 /ml為(wei) 宜。

培養(yang) 細胞
將符合細胞計數要求的細胞懸液分裝入培養(yang) 瓶內(nei) ，將培養(yang) 瓶放入37℃，5％CO 2 的培養(yang) 箱內(nei) 2-4h（或者24-48h）後換液繼續培養(yang) 培養(yang) ，換液的時間根據細胞情況而定。

記錄複蘇日期
結果分析
判斷細胞複蘇成功與(yu) 否，需要看複蘇後細胞貼壁率及細胞存活率（細胞存活率將凍存管內(nei) 剩餘(yu) 的細胞，台盼藍染色法檢測複蘇細胞的存活率。呈藍色的細胞為(wei) 死細胞，活細胞不著色。用細胞計數板和計數器計數細胞，得出細胞存活率）。
如果複蘇後95%以上的細胞貼壁，而且細胞的活性好，這就說明細胞複蘇的過程沒有問題。複蘇的細胞恢複到正常生長，達到正常的生長特性（比如細胞群體(ti) 倍增時間等）後要再凍存以補充細胞儲(chu) 存數量。

×× 初學者易犯錯誤 ××
水浴鍋未提前預熱或者未預熱到37℃直接融化。
水浴鍋內(nei) 凍存管太多，導致傳(chuan) 熱不佳，使融化時間延長。
離心前忘記平衡，導致離心機損壞和細胞丟(diu) 失。
一次複蘇細胞種類過多，忘記更換吸頭和吸管，導致細胞交叉汙染。

02、傳(chuan) 代

1.傳(chuan) 代密度過高
一旦細胞養(yang) 太久至融合度過高（>90%）才傳(chuan) 代，容易使細胞產(chan) 生老化現象，甚至是堆疊，再消化細胞時不易吹打成單顆細胞，即便再重新鋪盤傳(chuan) 代，細胞也無法回到原本的特性了。（如：單層細胞，沒長滿就發生堆疊現象）。

解決(jue) 方案
盡量避免融合度過高，鏡下觀察融合度約達到80%即可傳(chuan) 代分盤。
細胞融合度：在細胞培養(yang) 中指的是細胞在培養(yang) 表麵（培養(yang) 皿/瓶）所占的比例。

2.傳(chuan) 代密度過低
哺乳動物貼壁培養(yang) 細胞，若細胞培養(yang) 到 80-90%密度需要開始傳(chuan) 代，在傳(chuan) 代接種細胞密度過低，細胞間距離太遠，就無法在細胞間產(chan) 生黏附及通信作用，幫助信號傳(chuan) 導並活化細胞；總體(ti) 細胞量不足，分泌的生長因子濃度會(hui) 不足以產(chan) 生利於(yu) 生長的微環境，以上皆會(hui) 造成增殖速度遲緩或細胞死亡。

解決(jue) 方案
細胞傳(chuan) 代時，要進行準確的細胞計數，確保鋪盤的密度。

如何確定細胞的正確初始接種密度?

美國細胞庫（ATCC）建議各類不同細胞株接種密度：
細胞類型 接種密度
常見腫瘤細胞株 2-4 x 10 6 viable cells/25cm 2
成纖維細胞株 2-4 x 106 viable cells/25 cm2
淋巴細胞/懸浮細胞 3-4 x 10 5 viable cells/ml
雜交瘤 2 x 105 viable cells/ml
成肌細胞 1-2 x 10 4 viable cells/ cm2 

03、凍 存

細胞凍存的基本原理： 慢凍
手動降溫：將細胞依序放在4℃（30分鍾）、-20℃（1小時）、-80℃（過夜）後移至液氮中保存。
程序降溫盒：是一般廣泛使用的降溫法，為(wei) 一種特製冷凍容器（填充異丙醇或依靠特製金屬導熱），使細胞以每分鍾約-1℃的速度降至-80℃（過夜），然後移至液氮中保存。

大家可以根據自身情況或者實驗條件選擇不同的凍存方式。

細胞凍存是細胞保存的主要方法之一。利用凍存技術將細胞置於(yu) -196℃液氮中低溫保存，可以使細胞暫時脫離生長狀態而將其細胞特性保存起來，這樣在需要的時候再複蘇細胞用於(yu) 實驗。而且適度地保存一定量的細胞，可以防止因正在培養(yang) 的細胞被汙染或其他意外事件而使細胞丟(diu) 種，起到了細胞保種的作用。

細胞代謝過程需要各種蛋白酶的參與(yu) ，而這些蛋白酶在環境溫度低於(yu) -70℃時會(hui) 集體(ti) 罷工，低溫貯藏的目的是通過超低溫使代謝活動近乎停止。細胞因此進入休眠狀態，使細胞“不會(hui) 老"，可以長期保存。

因為(wei) 凍融過程對所有細胞和組織都是有一定傷(shang) 害的，因此，需要開發出有效的技術來防止細胞死亡和損傷(shang) 。

這時，低溫保護劑就發揮出它的作用了。

低溫保護劑可保護細胞不受細胞內(nei) 冰凍影響，目前多采用DMSO、甘油、乙二醇和丙二醇等滲透型低溫保護劑。它們(men) 的作用機製包括：自由進入細胞，取代水，使冰點下降，充當鹽的二次溶劑，提高細胞膜對水的通透性。

但是，部分低溫保護劑在緩慢冷凍過程中雖然會(hui) 保護細胞，但它們(men) 也會(hui) 引起細胞毒性，尤其是在室溫下。因此，在標準的自製凍存液中，會(hui) 含有血清，血清是用來降低細胞毒性的，但血清也不是完mei的。